A fehérjék és szerkezetük, működésük alapján az életjelenségek molekuláris szintű megértése vált a modern biológia fejlődésének fő irányvonalává. A fehérjék tanulmányozásához először nagy tisztaságú és biológiailag aktív célanyagokat kell beszereznünk. A fehérjék előállítása magában foglalja a fizika, a kémia és a biológia különböző aspektusait, de az alapelv nem más, mint két szempont. Az egyik az, hogy a keverékben lévő több komponens eloszlási sebességének különbségeit felhasználjuk két vagy több fázisra, amelyek mechanikai módszerekkel szétválaszthatók, például kisózással, szerves oldószeres extrakcióval, kromatográfiával és kristályosítással stb.; a második az, hogy A keveréket egyetlen fázisba helyezzük, és a komponenseket fizikai erőterek hatására ugyanarra a területre osztjuk szét, hogy elérjük az elválasztási célokat, mint például elektroforézis, ultracentrifugálás, ultraszűrés stb. módszerekkel, ügyelni kell a biológiai makromolekulák integritásának megőrzésére és a javasolt anyagok biológiai aktivitásának savak, lúgok, magas hőmérsékletek, súlyos mechanikai hatások által okozott elvesztésének megakadályozására. A fehérjék előkészítése általában a következő négy szakaszra oszlik: anyagkiválasztás és előkezelés, sejtroncsolás és organellum-elválasztás, extrakció és tisztítás, koncentrálás, szárítás és tartósítás. A mikroorganizmusok, növények és állatok egyaránt felhasználhatók alapanyagként a fehérjék előállításához, a kiválasztott anyagokat elsősorban a kísérlet célja alapján határozzák meg. A mikroorganizmusok esetében figyelmet kell fordítani a növekedési fázisukra. A mikroorganizmusok logaritmikus szaporodási fázisában magas az enzim- és nukleinsavtartalom, magas hozam érhető el. A mikroorganizmusok anyagként való felhasználásának két helyzete van: (1) Mikrobás sejtszekréciót kell használni. Metabolitok és extracelluláris enzimek a táptalajban; (2) Használja a baktériumokban található biokémiai anyagokat, például fehérjéket, nukleinsavakat és intracelluláris enzimeket. A növényi anyagokat hámozni és zsírtalanítani kell, és figyelmet kell fordítani a különböző növényfajtákra, valamint a növekedési és fejlődési feltételekre. A bennük lévő biológiai makromolekulák mennyisége nagyon változó, és szorosan összefügg a szezonalitásokkal. Az állati szöveteknél a hatóanyagokban gazdag szervszöveteket kell alapanyagul kiválasztani, ezeket először ledarálni és zsírtalanítani kell. Ezenkívül az előkezelt anyagokat le kell fagyasztani és tárolni, ha nem használjuk fel azonnal kísérletekre, illetve friss anyagokkal könnyen lebomló biomakromolekulákat kell készíteni. A fehérjék szétválasztása és tisztítása 1. Fehérjék (beleértve az enzimeket is) kinyerése A legtöbb fehérje oldódik vízben, híg sóban, híg sav- vagy lúgoldatban, míg a lipidekhez kötött fehérjék egy része szerves oldószerben, például etanolban, acetonban oldódik, butanol és így tovább. Ezért különböző oldószerek használhatók fehérjék és enzimek extrahálására, elválasztására és tisztítására. (1) Vizes oldatos extrakciós módszer. A híg só és pufferrendszer vizes oldata jó stabilitást és nagy oldékonyságot mutat a fehérjék számára. Ez a leggyakrabban használt oldószer a fehérjék kivonására. A szokásos adag a nyersanyag térfogatának 1-5-szerese. Az extrakció során egyenletes keverés szükséges a fehérjék oldódásának elősegítése érdekében. Az extrakciós hőmérséklet a hatóanyagok tulajdonságaitól függ. Egyrészt a legtöbb fehérje oldhatósága a hőmérséklettel nő. Ezért a magas hőmérséklet elősegíti az oldódást és lerövidíti az extrakciós időt. Másrészt a hőmérséklet emelkedése denaturálja és inaktiválja a fehérjéket. Ezért ezen megfontolás alapján a fehérjék és enzimek extrakciója során általában alacsony hőmérsékletű (5 fok alatti) műveleteket alkalmaznak. A fehérjeextrakció során bekövetkező bomlás elkerülése érdekében proteolitikus enzim-inhibitorokat (például diizopropil-fluor-foszfátot, jód-ecetsavat stb.) adhatunk hozzá.
Töményítés, szárítás és tartósítás 1. A minták sűrítése A biológiai makromolekulák előkészítése során a minták az oszlopos tisztítás miatt nagyon felhígulnak. A megőrzés és azonosítás érdekében gyakran koncentrációra van szükség. Általánosan használt töményítési módszerek: 1. A dekompressziós és melegítési bepárlási koncentráció a folyadék felületi nyomásának csökkentésével csökkenti a folyadék forráspontját. Minél nagyobb a dekompresszió vákuumfoka, annál alacsonyabb a folyadék forráspontja, és annál gyorsabban párolog el. Ez a módszer alkalmas egyes betegek számára, akik nem tolerálják a forró biológiai makromolekulák koncentrációját. 2. A légáram elpárolog és koncentrálódik. A levegő áramlása felgyorsíthatja a folyadék elpárolgását, és az oldatot vékony rétegben szétterítheti, miközben a levegőáram folyamatosan áthalad a felületen; vagy helyezze a biológiai makromolekula oldatot a dializáló zacskóba és helyezze hideg kamrába, és ventilátorral fújja ki a levegőt. A membránon áthaladó oldószer nem párolog el a koncentrálás céljának eléréséhez. Ez a módszer lassú koncentrálási sebességgel rendelkezik, és nem alkalmas nagy mennyiségű oldat sűrítésére. 3. Fagyasztási módszer: a biológiai makromolekulák alacsony hőmérsékleten jéggé fagynak. A sók és a biológiai makromolekulák nem jutnak be a jégbe, hanem a folyékony fázisban maradnak. Működés közben a sűrítendő oldatot először lehűtik, hogy szilárd anyaggá alakuljon, majd lassan megolvasztják. Az oldószer és az oldott anyag olvadáspontja közötti különbséget az oldószer nagy részének eltávolítására használják fel. Például, ha a fehérje és az enzim sóoldatát ezzel a módszerrel koncentrálják, tiszta jégkristályok fehérje és enzim nélkül lebegnek a folyadék felületén, és a fehérje és az enzim koncentrálódik az alsó oldatban. A felső jégkockák eltávolításával a fehérje és az enzim koncentrációja érhető el. folyékony. 4. Abszorpciós módszer: Az oldatban lévő oldatmolekulákat az abszorbensen keresztül közvetlenül összegyűjtjük, és koncentráljuk. A felhasznált abszorbens nem léphet kémiai reakcióba az oldattal, nem adszorbeálhat biológiai makromolekulákat, és könnyen elválasztható az oldattól. Az általánosan használt abszorbensek közé tartozik a polietilénglikol, a polivinil-pirrolidon, a szacharóz és a gél. Ha polietilénglikol abszorbereket használ, először tegye a biológiai makromolekula oldatot egy félig áteresztő membránzsákba, és adjon hozzá polietilénglikolt. Alkohollal letakarva és 4 Celsius fokon tárolva a tasakból kiszivárgó oldószert gyorsan felszívja a polietilénglikol. Miután a polietilénglikolt vízzel telítették, ki kell cserélni egy újjal, amíg el nem éri a kívánt térfogatot. 5. Ultraszűrés Az ultraszűrés egy olyan módszer, amely speciális membrán segítségével szelektíven szűri az oldatban lévő különböző oldott molekulákat. Amikor a folyadék bizonyos nyomáson (nitrogénnyomás vagy vákuumszivattyú nyomás) áthalad a membránon, az oldószer és a kis molekulák Keresztül a makromolekulák blokkolódnak és megmaradnak. Ez egy új módszer, amelyet az elmúlt években fejlesztettek ki. Leginkább biológiai makromolekulák, különösen fehérjék és enzimek sűrítésére vagy sótalanítására alkalmas. Olcsó, könnyű kezelhetőség, enyhe körülmények, és jobban karbantartható. Előnye a biológiai makromolekulák nagy aktivitása és a magas visszanyerési sebesség. Az ultraszűrés alkalmazásának kulcsa a membránok kiválasztása. A membránok különböző típusai és specifikációi eltérő paraméterekkel rendelkeznek, mint például a víz áramlási sebessége és a molekulatömeg határértéke (vagyis a molekulák minimális molekulatömeg-értéke, amelyet a membrán megtarthat), és ezeket a munkaigényeknek megfelelően kell kiválasztani. Ezenkívül az ultraszűrő berendezés formája, az oldott anyag összetétele és tulajdonságai, az oldat koncentrációja stb. mind-mind bizonyos hatással van az ultraszűrő hatásra. Az üreges szálas csöveket ultraszűrő membránokból készítik, és sok ilyen csövet kötegbe gyűjtenek. A csövek mindkét vége alacsony ionerősségű pufferrel van összekötve, így a puffer folyamatosan áramlik a csőben. A rostcsövet ezután a dializálandó fehérjeoldatba merítik. Amikor a puffer átfolyik a rostcsövön, a kis molekulák könnyen átdiffundálhatnak a membránon, de a nagy molekulák nem. Ez a szálszűrős dialízis módszer. A megnövekedett dialízisterület miatt a dialízis ideje 10-szeresére rövidül. 2. Szárítás: A biológiai makromolekulákból készült termékeket a romlás megelőzése és a tárolás megkönnyítése érdekében gyakran szárítani kell. A leggyakrabban alkalmazott módszerek a fagyasztva szárítás és a vákuumszárítás. A vákuumszárítás alkalmas olyan anyagok szárítására, tartósítására, amelyek nem ellenállnak a magas hőmérsékletnek és hajlamosak az oxidációra. A szárító, kondenzátor és vákuum szárítás elve mellett az egész készülék hozzáadja a hőmérsékleti tényezőt is. Ugyanazon nyomáson a vízgőz nyomása a hőmérséklet csökkenésével csökken, így alacsony hőmérsékleten és alacsony nyomáson a jég könnyen gázzá szublimál. Működés közben a szárítandó folyadékot általában először fagyáspont alatt lefagyasztják, hogy szilárd halmazállapotúvá alakuljon, majd az oldószert alacsony hőmérsékleten és alacsony nyomáson gázzá alakítják és eltávolítják. Az ezzel a módszerrel szárított termékek a lazaság, a jó oldhatóság és a természetes szerkezet megőrzésének előnyei, valamint alkalmasak különféle biológiai makromolekulák szárítására és konzerválására. 3. Tárolás A biológiai makromolekulák stabilitása szorosan összefügg a tárolási módszerrel. A száraz termékek általában viszonylag stabilak, aktivitásuk alacsony hőmérsékleten napokig vagy akár évekig változatlan maradhat. A tárolási követelmények egyszerűek, feltéve, hogy a szárított mintákat exszikkátorba helyezzük (szárítószert tartalmaz), és lezárjuk, és a következő helyen tároljuk: 0-4 Folyadékok tárolásánál a következőkre kell ügyelni: 1. A minta ne legyen túl hígított. Csomagolás és tárolás előtt be kell koncentrálni egy bizonyos koncentrációra. A túl híg minta könnyen denaturálhatja a biológiai makromolekulákat. 2. Általában tartósítószereket és stabilizátorokat kell hozzáadni. Az általánosan használt tartósítószerek közé tartozik a toluol, benzoesav, kloroform, timol stb. A fehérjékhez és enzimekhez általában használt stabilizátorok közé tartozik az ammónium-szulfát paszta, szacharóz, glicerin stb. Az enzimekhez szubsztrátok és koenzimek is hozzáadhatók stabilitásuk javítására. Ezenkívül az olyan oldatok, mint a kalcium, a cink és a bórsav, bizonyos enzimekre bizonyos védőhatással is rendelkeznek. A nukleinsav-makromolekulákat általában nátrium-klorid vagy nátrium-citrát standard pufferoldataiban tárolják. 3. A tárolási hőmérsékleti követelmények alacsonyak, a legtöbbet hűtőszekrényben tárolják 0 fok körül, és vannak, amelyek alacsonyabb hőmérsékletet igényelnek, különböző anyagoktól függően.